Mit Luthers Thesenanschlag vom 31.10.1517 in Wittenberg begann die Reformation in Deutschland. Es war zunächst ein Protest gegen kirchliche Missstände, namentlich die Ablasspraktiken der kirchlichen Kurie. Insgesamt soll Luther elfmal in Jena gewesen sein. In den thüringischen Besitzungen der Ernestiner fanden Luthers Gedanken starken Widerhall, letztlich führten seine Proteste zur Abtrennung der evangelischen Kirchen von der römisch-katholischen.
Jena ist protestantisch geprägt, was sich auch zahlenmäßig in der Religionszugehörigkeit der Bürger widerspiegelt.